Forschungsprojekte und Kooperationen

Kooperationspartner:

Ass.-Prof. Dr. med. Young-Ae Lee (Klinik für Pädiatrie, Charité Berlin / MDC Berlin)

Die atopische Dermatitis (AD; atopisches Ekzem, Neurodermitis) ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die 10-20% der Kinder und 1-3% der Erwachsenen in westlichen Industrienationen betrifft und deren Inzidenzrate momentan um den Faktor 5-10 zunimmt. Die AD wird als multifaktorielle Krankheit betrachtet, bei der sowohl genetische als auch umweltbedingte Einflussgrößen eine Rolle spielen. Hierbei wird insbesondere die Schwächung bzw. Störung der Barrierefunktion der Haut als wichtiges klinisches Merkmal angesehen. Die Haut eines AD Patienten ist gekennzeichnet durch eine merkliche Trockenheit bedingt durch einen steigenden transepidermalen Wasserverlust und außerordentlicher Empfindlichkeit gegenüber physikalischen und chemischen Reizstoffen. Auch wird bei den Erkrankten eine verminderte Barriere gegenüber Mikroben beobachtet, die in einer stärkeren Anfälligkeit für bakterielle und virale Hautentzündungen zum Ausdruck kommt. Des Weiteren ist die AD eng assoziiert mit einer allergischen Sensibilisierung, die letztendlich auf eine erhöhte Permeabilität der Haut in Bezug auf Umweltallergene zurückzuführen sein könnte.

Im Rahmen des Forschungsnetzwerkes „Umweltbedingte Erkrankungen“ innerhalb des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) hat es sich die Kieler Forschungsgruppe zur Aufgabe gemacht, genetische Risikofaktoren für die AD zu identifizieren. Dieses geschieht in enger Kooperation mit der Hautklinik an der TU München (PD Dr. med. Stephan Weidinger) und der Klinik für Pädiatrie an der Charité in Berlin (Ass.-Prof. Dr. med. Young-Ae Lee), sodass momentan eine gemeinsame Studienkohorte von über 4.000 Patienten und mehr als 15.000 gesunden Vergleichsprobanden genutzt werden kann. In der Vergangenheit konnte diese kostbare Ressource auch schon erfolgreich genutzt werden, sodass u.a. ein bedeutsamer AD Risikolocus in der chromosomalen Region3q21 lokalisiert wurde (Lee et al. 2000) und das jüngst identifizierte, erste Risikogen für das atopische Ekzem (FLG) in der Kieler, Berliner und Münchner Studiengruppe bestätigt werden konnte (Ruether et al. 2006, Marenholz et al. 2006, Weidinger et al. 2006). Der Großteil der abgeschlossenen und aktuell laufenden Studien basiert im Ansatz auf dem Prinzip der Assoziationsstudie bei der ein umfangreiches Methodenspektrum zum Einsatz kommt. Am Kieler Standort werden hierbei insbesondere die Plattformtechnologien Genotypisierung (TaqMan- und SNPlex-Technologie) und Sequenzierung (Sanger-Technologie) des Institutes für Klinische Molekularbiologie (IKMB) genutzt. Neben der Durchführung vielversprechender Kandidatengenstudien, die z.T. auf funktionellen Studien aus dem Bereich der Hautklinik aufbauen, sieht die aktuelle Projektplanung des AD Forschungskonsortiums die Durchführung einer genomweiten Studie mit Hilfe der 1000k-SNP-Chip-Technologie (Affymetrix) auf der Basis einer Studienkohorte von mehr als 2.000 Patienten und Kontrollpersonen vor.

Genetik von Varikosis und chronisch venöser Insuffizienz
Projektleiter: Dr. rer. nat. Andreas Fiebig

Kooperationspartner:
Chefarzt Dr. med. Norbert Frings, Mosel-Eifel-Klinik, Fachklinikm für Venenerkrankungen, Bad Bertrich
PD. Dr. med. Schaller, Dermatohistologisches Labor, Laborgemeinschaft Dr. Schaller & Dr. Hendricks Katholisches Klinikum Duisburg, Akademisches Lehrkrankenhaus der Universität Düsseldorf, St. Barbara-Hospital, Duisburg

Fragestellung: Die chronischen Venenkrankheiten, wie die Varikosis, das postthrombotische Syndrom und die chronisch venöse Insuffizienz, gehören zu den häufigsten Krankheitsbildern der westlichen Welt. In Folge dieser Erkrankungen kommt es sowohl zu anhaltenden Beschwerden, wie Schweregefühl, Schwellungsneigung und Schmerzen in den Beinen, als auch zu massiven Hautveränderungen bis hin zum offenen Bein (Ulcus cruris). Die Bonner Venenstudie (2003) zur Frage der Häufigkeit und Ausprägung von chronischen Venenkrankheiten in der städtischen und ländlichen deutschen Wohnbevölkerung (im Alter von 18-79 Jahren) ergab, dass lediglich 9,2 % der Probanden keine Venenveränderungen aufweisen, aber 14,2 % unter der Ausprägung von Krampfadern leidet. Eine chronisch venöse Insuffizienz wurde bei jedem 6. Mann und jeder 5. Frau diagnostiziert. Aus der hohen Prävalenz der chronischen Venenerkrankungen in der deutschen Bevölkerung resultiert auch eine außerordentliche Belastung für die Haushalte der Krankenversicherungen.

Zielsetzung: Identifikation der prädisponierenden Gene für die Krankheiten Varikosis und chronisch venöse Insuffizienz

Projektbeschreibung:
Das Projekt wurde als Kooperation zwischen dem Institut für Klinische Molekularbiologie in Kiel und der Venenfachklinik Mosel-Eifel-Klinik in Bad Bertrich initiiert. Zusätzlich sind an dem Projekt die Biodatenbank Popgen in Kiel und das Dermatologisch-histologische Labor von PD Dr. med. Schaller im St. Barbara-Hospital in Duisburg darin involviert. Aufgrund der Kooperation des IKMB mit der größten Venenfachklinik Europas (mit ca. 3.000 stationären und 4.000 ambulanten Operationen), konnten wir in 2 Jahren, seit Beginn des Projektes, über 2.300 Patienten der Mosel-Eifel-Klinik für unsere Studie gewinnen. Von allen rekrutierten Patienten sind wir im Besitz von 30 ml EDTA-Blut, für die spätere DNA-Isolation, sowie eines umfangreichen Fragebogens, der sämtliche Aspekte, wie die exakte Phänotypisierung des Krankheitsbildes (nach CEAP-Klassifikation), bisherige Behandlungsmethoden, potentielle Risikofaktoren und die familiäre Neigung (Stammbaum mit der Pathologie aller Familienangehörigen über 3 Generationen), beinhaltet. In Zusammenarbeit mit dem Dermatologisch-histologischen Labor von PD Dr. med. Schaller wurden von 1.700 unserer Probanden Biopsien für histologische Untersuchungen und Expressions-Studien gesammelt.

Wir haben die bislang mit Abstand weltweit größte Kohorte von Patienten mit chronischen Venenkrankheiten aufgebaut. Diese Kohorte und die umfangreichen Genotypisierungstechniken (TaqMan, SNPlex) unseres Instituts bilden eine exzellente Ausgangsposition, die prädisponierenden Gene für Varikosis und die chronisch venöse Insuffizienz zu identifizieren. Das Projekt ist eingebettet in die Popgen-Struktur. Wir planen bis Ende 2007 die Kohorte auf ca. 3.000 Probanden erweitert zu haben, parallel dazu wird DNA aus dem Blut isoliert.

Als Kontrollen konnten wir bislang mit der Hilfe der Biobank Popgen 820 Varizen-freie Probanden rekrutieren. Wir planen die Zahl der Kontrollen langfristig auf über 2.000 zu erhöhen.

Hintergrund:

Epidemiologische Studien zeigen, dass die Lebenserwartung des Menschen zu 25-32% durch genetische Faktoren bestimmt wird. Darüber hinaus sind in verschiedenen Modellorganismen (S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster, M. musculus) Mutationen in Genen identifiziert worden, welche die Lebensspanne in diesen Spezies beeinflussen. Obwohl bereits große Fortschritte in der Aufdeckung genetischer Varianten mit lebensverlängerndem oder -verkürzendem Effekt in Modellorganismen erzielt wurden, ist über die zugrunde liegenden genetischen Determinanten und Mechanismen beim Menschen nur wenig bekannt. Die einzige bisher gesicherte genetische Einflussgröße auf die menschliche Lebenserwartung ist das Apolipoprotein-E-Gen (APOE). Die ε4-Variante dieses Gens erhöht nachweislich das Krankheitsrisiko für Morbus Alzheimer und Herz-Kreislauferkrankungen und tritt bei hochbetagten Individuen (90 Jahre +) seltener auf als in der Gesamtbevölkerung.

DNA-Sammlung von hochbetagten Personen und Hundertjährigen

Die Forschungsgruppe „Gesundes Altern“ leistet in groß angelegten Projekten einen Beitrag zur systematischen Erforschung der genetischen Basis der Lebenserwartung. Dazu wurde eine weltweit einmalige DNA-Sammlung von hochbetagten Personen, die 90 Jahre und älter sind, zusammengestellt. Diese Stichprobe umfasst momentan rund 2960 DNA Proben; 660 der rekrutierten Probanden hatten zum Zeitpunkt der Probenentnahme ein Alter von mehr als 100 Jahren erreicht.

Augenblicklich führen wir mit Hilfe unserer Stichproben gezielte Untersuchungen an Kandidatengenen durch. Die Auswahl der Kandidatengene erfolgt auf der Basis bisheriger Befunde in Modellorganismen und beinhaltet Gene mit Funktionen in vermutlich altersrelevanten Pathways wie z.B. Insulin/IGF1-Signalling, DNA-Reparatur Mechanismen und Resistenz gegenüber oxidativem Stress. Bisher wurden mehrere Hundert Einzelbasenpolymorphismen (SNPs), die in ausgewählten Kandidatengenen lokalisiert sind, in Probanden (1100 Individuen, 95 Jahre und älter) und einer jüngeren Kontrollgruppe (1100 Personen, 60-75 Jahre) untersucht. Dabei ist bislang ein Kandidatengen identifiziert worden, das mit der Lebenserwartung in der deutschen Bevölkerung assoziiert ist. Der Befund wurde in einer unabhängigen Stichprobe Hochbejahrter und Kontrollen (europäischer Herkunft) bestätigt. Das entsprechende Genprodukt spielt eine wichtige Rolle bei der DNA-Reparatur. Weiterführende funktionelle Studien werden zur Zeit durchgeführt.

Zu den verwendeten Technologien gehören SNPlex, TaqMan sowie Sanger Sequenzierung und eine Reihe zellbiologischer Untersuchungsmethoden.

Die Kandidatengenstudie wird im Rahmen des Explorativen Projektes „Genetic etiology of human longevity“ durchgeführt, das durch das Nationale Genomforschungsnetz (NGFN) gefördert wird.

Signaltransduktionswege des Immunsystems und Dilatative Kardiomyopathie
Projektleiter: Dr. rer. nat. Arne Schäfer

Kooperationspartner:
OA N. E. El Mokhtari, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Klinik für Kardiologie
Prof. H. Katus, Universitätsklinikum Heidelberg, Innere Medizin III
Prof. M. Stoll, Leibniz-Institut für Arterioskleroseforschung an der Universtiät Münster

Fragestellung:
Die dilatative Kardiomyopathie ist eine Erkrankung des Herzmuskels, bei der die Herzkammern und die Herzvorhöfe vergrößert sind. Gleichzeitig ist die Pumpfähigkeit des Herzens eingeschränkt. Hierdurch kommt es zu einer Mangelversorgung des Organismus mit den Krankheitszeichen einer Herzschwäche.

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist die häufigste Form der Herzmuskelerkrankung (6 Promille). Als möglicher Auslöser wird eine Virusinfektion vermutet, denn bei vielen Betroffene hat man in Untersuchen entzündliche Infiltrate im Herzmuskel entdeckt. Außerdem ist bei vielen Betroffenen eine erhöhte Produktion von Immunglobulinen vom Typ IgG vorhanden, was auf eine Aktivierung des Immunsystems durch einen Erreger hinweist. Es ist daher anzunehmen, dass Reaktionen des Autoimmunsystems auf pathogeninduzierte Entzündungsprozesse einen wesentlichen Einfluß auf die Pathogenese Dilatativer Kardiomyopathie (DCM) haben. Eine genetische Disposition als Auslöser einer dilatativen Kardiomyopathie wird als gesichert angesehen. Die Zahl der diesbezüglich Betroffenen wird auf ungefähr 20 Prozent der auftretenden Fälle geschätzt.

Da sich Hinweise häufen, dass Reaktionen des Autoimmunsystems auf pathogeninduzierte Entzündungsprozesse einen wesentlichen Einfluß auf die Pathogenese von DCM haben, sollen die Projekte klären, ob genetische Risikoallele innerhalb der das Immunsystem aktivierenden TLR- und IL6-Signaltransduktionswege die Sukzeptibilität für DCM erhöhen.

Ziele:
Ziel ist die Identifizierung sämtlicher Allele des Toll-Like Rezeptor (TLR) und des Interleukin-6 (IL6) Signalweges, die eine Prädisposition zu DCM begünstigen.

Projektbeschreibung:
136 Polymorphismen in 15 Genen zentraler Positionen des TLR-Signalweges (TLRs, Cofaktoren, Adaptoren, Proteinkinasen) und 82 Polymorphismen in elf Genen des IL6-Signalweges (Rezeptoren, Liganden und Signaltransduktoren) werden in einer Kandidatengen Fall-Kontroll-Assoziationsstudie untersucht. Um die gesamte Haploinformation der untersuchten Gene sättigend abzudecken, sind „tagging“ SNPs (tSNP) ausgewählt worden. Diese werden durch nsSNPs sowie funktionale SNPs ergänzt, bei denen in anderen Studien bereits eine Assoziation zu Entzündungskrankheiten nachgewiesen wurden.

Als Kartierungspopulation steht eine nord- und süddeutsche DCM-Kohorte zur Verfügung. Diese umfasst Blutproben (DNA) von 1.038 DCM-Patienten, sowie alle wesentlichen klinischen Informationen. Eine DCM wurde durch klinische Diagnose gesichert. Darüber hinaus steht über popgen eine bevölkerungsbasierte Kontrollpopulation zur Verfügung, die insgesamt mehr als 4.500 Individuen umfasst.

Das Projekt ist Bestandteil des NGFN.

Kohortengröße:
1038 DCM Patienten
1100+1000+1800 Kontrollen

Technologien:
Kartierung:
· The GeneChip® Human Mapping 500K Array Set
· SNPlex™ technology (www.appliedbiosystems.com)
· TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Mutationsdetektion:
· ABI PRISM 3700 DNA Analyzers (sequencing of genomic DNA) using BigDye chemistry (www.appliedbiosystems.com). In addition next generation sequencing technologies (development partner for Roche GS flx and Agencourt/ABI SOLiD) are available.
Transkriptprofilierung:
· TaqMan7900 HT (Applied Biosystems)

Signaltransduktionswege des Immunsystems und Koronare Herzkrankheit
Projektleiter: Dr. rer. nat. Arne Schäfer

Kooperationspartner:
OA N. E. El Mokhtari, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Klinik für Kardiologie
Professor H. Schunkert, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Medizinische Klinik II
Prof. H. Katus, Universitätsklinikum Heidelberg, Innere Medizin III
Prof. M. Stoll, Leibniz-Institut für Arterioskleroseforschung an der Universtiät Münster

Fragestellung:
Studien der letzten Jahre haben mehrfach gezeigt, daß Reaktionen des Autoimmunsystems auf pathogeninduzierte Entzündungsprozesse einen wesentlichen Einfluß auf die Pathogenese Koronarer Herzkrankheiten (KHK) haben. Die Atheriosklerose ist charakterisiert als Akkumulation von Lipiden in der Arterienwand, begleitet von einer chronischen Entzündung. Toll-Like Rezeptoren (TLR) interagieren sowohl mit exogenen als auch mit endogenen Pathogenen und sind ein zentraler Bestandteil der unspezifischen, angeborenen Immunität. Sie sind die initialen Rezeptoren für eindringende Mikroben (Bakterien, Pilze, Viren und Protozoen), jedoch interagieren sie auch mit endogenen Pathogenen wie dem oxidiertem LDL (oxLDL). Eine weitere wichtige Rolle in der Pathologie der KHK spielt Interleukin-6 (IL-6), das zu einer Aktivierung der Akutphase Proteine wesentlich beiträgt. Insbesondere wird durch IL-6 die Transkription des C-Reaktiven Proteins (CRP) aktiviert. In verschiedenen Studien konnte zuletzt die Beteiligung von Mitgliedern des Toll-Like Rezeptor- (TLR) und des IL6-Signalweges an der Entstehung von Atherosklerose und KHK demonstriert werden. Bisher wurden von anderen Arbeitsgruppen ausschließlich genetische Polymorphismen der TLR-2, TLR-4 Gene und des Promoters des IL-6 Genes im Zusammenhang mit der KHK untersucht. Diese Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine mögliche Assoziation mit der KHK, bei insgesamt nicht einheitlichen Ergebnissen.

Die laufenden Projekte vertiefen diese Hypothesen für den TLR- und IL6-Signalweg und testen Polymorphismen ausgewählter Gene anhand von Kandidatengen-Assoziations-Fall-Kontroll Studien.

Ziele:
Ziel ist die Identifizierung sämtlicher Allele des Toll-Like Rezeptor (TLR) und des Interleukin-6 (IL6) Signalweges, die eine Prädisposition zu KHK begünstigen.

Projektbeschreibung:
136 Polymorphismen in 15 Genen zentraler Positionen des TLR-Signalweges (TLRs, Cofaktoren, Adaptoren, Proteinkinasen) und 82 Polymorphismen in elf Genen des IL6-Signalweges (Rezeptoren, Liganden und Signaltransduktoren) werden in einer Kandidatengen Fall-Kontroll-Assoziationsstudie untersucht. Um die gesamte Haploinformation der untersuchten Gene sättigend abzudecken, sind „tagging“ SNPs (tSNP) ausgewählt worden. Diese werden durch nsSNPs sowie funktionale SNPs ergänzt, bei denen in anderen Studien bereits eine Assoziation zu Entzündungskrankheiten nachgewiesen wurden.

Als Kartierungspopulation steht die popgen-Kohorte „Koronare Herzerkrankung“ zur Verfügung. Diese umfasst Blutproben (DNA) von 3.350 Patienten sowie alle wesentlichen klinischen Informationen. Eine KHK ist durch Koronarangiographien gesichert. 1.450 dieser Patienten sind 55 Jahre oder jünger und erfüllen somit das Kriterium einer vorzeitigen KHK. Darüber hinaus steht über popgen eine bevölkerungsbasierte Kontrollpopulation zur Verfügung, die insgesamt mehr als 4.500 Individuen umfasst.

Das Projekt ist Bestandteil des NGFN

Kohortengröße:
3.350 Patienten mit gesicherter Koronarangiographie (1450 davon jünger als 55 Jahre),
4500 Kontrollen

Technologien:
Kartierung:
· The GeneChip® Human Mapping 500K Array Set
· SNPlex™ technology (www.appliedbiosystems.com)
· TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Mutationsdetektion:
· ABI PRISM 3700 DNA Analyzers (sequencing of genomic DNA) using BigDye chemistry (www.appliedbiosystems.com). In addition next generation sequencing technologies (development partner for Roche GS flx and Agencourt/ABI SOLiD) are available.
Transkriptprofilierung:
· TaqMan7900 HT (Applied Biosystems)

Europäische Parodontitis-Genetik Studie
Projektleiter: Dr. rer. nat. Arne Schäfer

Kooperationspartner:
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel
PD Dr. B. Größner-Schreiber, Dr. A. Rühling, Klinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie, Kiel
Prof. Dr. Dr. S. Jepsen, Dr. C. Schäfer, Parodontologie und Zahnerhaltungskunde, Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Prof. Dr. B. Loos, Prof. U. van der Velden, Department of Periodontology, Academic Center for Dentistry Amsterdam (ACTA)
Prof. Dr. K. L. Schenk, Department of Oral Biology, University of Oslo

Seit 2005 wurden Kontakte zu folgenden Universitäten hergestellt (alphabetisch):
Aachen, Berlin, Dresden, Frankfurt, Freiburg, Gießen, Greifswald, Heidelberg, Jena, Münster.

Fragestellung:
Parodontopathien sind Erkrankungen des Zahnhalteapparates, der aus der Gingiva, dem parodontalen Ligament, dem Wurzelzement und dem eigentlichen Alveolarknochen besteht. Die entzündlichen Formen, d.h. Parodontitiden, nehmen aufgrund der hohen Prävalenz sowie der gravierenden Folgen für den Erhalt der Zähne und die Gesundheit des Gesamtorganismus der betroffenen Patienten eine herausragende Stellung ein. Parodontitiden führen nicht nur zu einer verminderten Lebensqualität und einem erhöhten Risiko für systemische Erkrankungen, z.B. koronare Herzerkrankung und Schlaganfall, sondern stellen auch ein enormes gesundheitsökonomisches Problem dar. So sind bereits in der Altersgruppe der 35- bis 44-Jährigen über 70% der Bundesbürger an einer Parodontitis erkrankt (4. Deutschen Mundgesundheitsstudie, DMS IV).

Die zunehmende Prävalenz von Parodontopathien und deren erfolgreiche Prävention und Therapie erfordert ein besseres Verständnis der entzündlichen, gewebedestruktiven sowie regenerativen Vorgänge im Parodont.. Neben Umwelteinflüssen, die das Risiko an einer Parodontose zu erkranken stark erhöhen (zu den größten Umweltrisiken zählt dabei das Rauchen), ist in Segregationsanalysen eine starke genetische Disposition bezüglich des Verlaufes der Erkrankung festgestellt worden. Die Suche nach genetischen Sukzeptibilitätsfaktoren ist aktuell Gegenstand der Forschung verschiedener Arbeitsgruppen.

Den schwersten Verlauf zeigt die Aggressive Parodontitis (AP). Diese Form wird vor dem Erreichen des 35. Lebensjahres diagnostiziert und führt unbehandelt durch raschen parodontalen Abbau und Knochendestruktion zu frühzeitigem Zahnverlust. Aufgrund der Schwere des Krankheitsverlaufes und der starken familiären Häufung, dient AP in den laufenden genetischen Studien als Modellkrankheit zur Identifikation genetischer Risikofaktoren. Dabei werden folgende Fragestellungen untersucht:

(1) Sind pathophysiologisch relevante Gene auch im Sinne einer genetischen Sukzeptibilität an der Ätiologie beteiligt ?
(2) Wie stark erhöht eine genetische Variabilität in diesen Genen das absolute Krankheitsrisiko bzw. wie beeinflusst sie den Verlauf der Erkrankung?
(3) Welche funktionale Rolle spielen die identifizierten Varianten (regulatorische oder strukturell) im Mechanismus.
(4) Wie werden pathophysiologisch zentrale Gene in Parodontalerkrankungen exprimiert. Diese sollen dann in gesundheitspolitisch bedeutenderen Parodontiditen wie Chronischer Parodontose überprüft werden.

Ziele:
Das mittelfristige Ziel des Projektes besteht darin, die ätiopathogenetischen Prozesse im Zusammenhang parodontaler Erkrankungen zu verstehen. Fernziel ist die Erstellung eines epidemiologischen Modells der genetischen Risikofaktoren verschiedener Parodontopathien. Dazu ist es geplant, systematische, genomweite Assoziationsuntersuchungen in der Zukunft durchzuführen.

Projektbeschreibung:
Seit 2002 hat die Studiengruppe in einer internationalen Kooperation eine DNA Sammlung von 636 AP-Patienten aufgebaut. In dieser Größe ist sie unseres Wissens weltweit einmalig.
Zusätzlich wird derzeit eine DNA-Sammlung mit Patienten Chronischer Parodontitis aufgebaut. Als Fernziel soll sie in den nächsten Jahren mehrere 1000 Patienten dieser sehr viel häufigeren Krankheit umfassen.

Auf Grundlage dieser DNA-Banken werden innerhalb der Europäischen Parodontitis-Genetik Studie am IKMB folgende Projekte bearbeitet:
(1) Assoziationsuntersuchungen zentraler Kandidatengene (inkl. Regulationskaskaden) in Populationen von Patienten mit aggressiver und chronischer Parodontitis (Typisierung mit SNPlex). Haplotyp basierte Überprüfung des jeweiligen Genlokus mit jeweils zusätzlich regulierenden und codierenden SNPs (tSNPs ergänzt durch ns-/cSNPs). Falls notwendig Re-Sequenzierung (Mutationsdetektion) zur Komplettierung des SNP Markersets. Für Gene mit „copy-numer-variations“ wurde eine neue PCR/Klonierungs-basierte Methode und eine Hochdurchsatz-Pyrosequenzierungsstrategie entwickelt.
(2) Replikation assoziiererter Marker in unabhängigen Patientenpopulationen (TaqMan). Sequenzierung der verifizierten Loci von Krankheitsgenen (ABI 3730) und Feinkartierung durch Genotypisierung (SNPlex) oder Resequenzierung auch in größeren Stichproben (Roche/454 GS-FLX). Genotyp-Phänotyp Untersuchungen von positiven Assoziationsbefunden.
(3) Herstellung stabiler transgener Zellen (HEK 293 Zellen) mit mutierten Genkonstrukten. Funktionelle Charakterisierung genetisch wichtiger Risikovarianten in experimentellen in vitro Systemen.
(4) Aufbau einer Gingivitis Gewebe- und cDNA-Bank aus gesunden und CP- und AP-Patienten. Herstellung eines Gewebspanels im 384-well Format zur Expressionsprofilierung pathophysiologisch zentral wichtiger Gene (realtime TaqMan).

Das Projekt ist Bestandteil der ARPA-Wissenschaftsstiftung und der BONFOR (Bonn)

Kohortengröße:
636 individuelle DNA Proben von Patienten mit Aggressiver Parodontitis.
1368 individuelle DNA Proben Parodontitis-freier Kontrollen.

Technologien:
Kartierung:
· The GeneChip® Human Mapping 500K Array Set
· SNPlex™ technology (www.appliedbiosystems.com)
· TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Mutationsdetektion:
· ABI PRISM 3700 DNA Analyzers (sequencing of genomic DNA) using BigDye chemistry (www.appliedbiosystems.com). In addition next generation sequencing technologies (development partner for Roche GS flx and Agencourt/ABI SOLiD) are available.
Transkriptprofilierung:
· TaqMan7900 HT (Applied Biosystems)

Molekulare Profile in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
Projektleiter: Dr. rer. nat. Robert Häsler

Kooperationspartner:
CONARIS research Institute Kiel
Max Planck Institut für Informatik, Saarbrücken
Max Planck Institut für Moekulare Genetik, Berlin

Das im Rahmen des NGFN Pathway-Mapping geförderte Projekt zielt darauf ab, die komplexen pathophysiologischen Abläufe bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED, Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa) auf molekularer Ebene besser zu verstehen. Besonderes Interesse gilt hierbei den transkriptionellen Profilen.

Hierzu wurden von 10 Morbus Crohn Patienten, von 10 Colitis Ulcerosa Patienten und von 10 gesunden Individuen genomweite Expressionsprofile erstellt. Gewonnene Ergebnisse wurden in einer weiteren Kohorte von über 100 Individuen mittels TaqMan Real Time PCR verifiziert.
Hauptbefund des Projektes ist die stark gestörte Zellphysiologie der Epithelien bei CED, dargetstellt z.B.: durch Gene wie CYLD und CDH11.

Viele der identifizierten Gene können als Ausgangspunkt für weitere Studien, sowie langfristig für die Entwicklung neuer Therapien eingesetzt werden. Zum Zweck der Entwicklung von Therapien ist dieses Projekt eng an
Industriekooperationen angebunden.

Literatur

Systematisch Expressionsanalyse innerhalb des SFB 415
Projektleiter: Dr. rer. nat. Robert Häsler

Kooperationsparter im SFB 415

Im Rahmen des SFB 415 "Spezifität und Pathophysiologie von Signaltransduktionswegen" wurde seit 2001 ein zentrales Projekt zur systematischen Expressionanalyse eingerichtet. In Zusammenarbeit mit über 20 Arbeitsgruppen aus dem Forschungsumfeld der Christian Albrechts Universität Kiel, des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein sowie des
Forschungszentrums Borstel wurden 2001 vier themenspezifische Microarrays entwickelt (Apoptose, Differenzierung, Entzündung, Maus). Im Laufe des Projektes wurde das Methodenspektrum um sogenannte TaqMan Low-Density-Arrays (Applied Biosystems) und Affymetrix GeneChips erweitert.

Ein wesentlicher Teil des Projektes ist die Bioinformatische Auswertung der gewonnenen Daten und die enge Zusammenarbeit mit den Teilprojekten. Die Förderung für den SFB 415 läuft noch bis 2010.

Links:
Affymetrix Chip-Technologie
Applied Biosystems

Expressionanalyse als Werkzeug für die Vorhersage des Therapieansprechens bei der akuten lymphoblastischen Leukämie im Kindesalter.
Projektleiter: Dr. rer. nat. Robert Häsler

Kooperationspartner:

Klinik für allgemeine Pädiatrie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Kiel

Das von der Deutschen Krebshilfe geförderte Projekt soll, aufbauend auf vorangegangenen Studien, eine Gruppe von Markergenen ermitteln, die eine Vorhersage des Therapieansprechens bei der akuten lymphoblastischen Leukämie im Kindesalter ermöglichen. Die akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist die häufigste bösartige Erkrankung des Kindesalters. Das Projekt erfolgt in Zusammenarbeit mit M. Schrappe (Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Kiel) und G. Cario (Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Kiel). Die Kooperationspartner leiten die ALL-BFM 2000 Therapieoptimierungsstudie, in der ca. 80% der in Deutschland diagnostizierten ALLs im Kindes- und Jugendalter aufgenommen werden, was einer Zahl von etwa 400 - 450 Fällen pro Jahr entspricht.
Bis 2009 sollen mittels TaqMan Low Density Arrays ca 90 Gene in einer Kohorte von ca. 300 Patienten analysiert werden. Die Genexpression wird mittels bioinformatischer Methoden mit dem Therapieerfolg assoziiert. Fokussiert werden soll in dieser Untersuchung auf die B-Vorläuferzell-ALL, da in dieser Gruppe die meisten der Rezidive auftreten, die mit den heute verfügbaren Stratifizierungswerkzeugen nicht vorhergesagt werden können.
Ziel ist die Identifikation eines umschriebenen Sets an Genen, deren Expressionsmessung zu einer verbesserten Risikostratifizierung beitragen kann. Darüber hinaus erhofft man sich ein besseres Verständnis der Ursachen von Therapieerfolg und –versagen.

Literatur

NOD und NALP Proteine als phylogenetisch alte Sensoren der angeborenen Immunität
Projektleiter: Prof. Dr. med. Philip Rosenstiel

NOD Proteine stellen als intrazelluläre Rezeptoren zur Erkennung von Bakterienwandbestandteilen offenbar eine entscheidende Komponente der immunologischen Barrierefunktion gegen zytoinvasive Pathogene dar. Es konnte gezeigt werden, dass NOD2 intestinale Epithelzellen sensitiviert, Bakterienwandbestandteile zu erkennen und die Sekretion des chemotaktischen Zytokins IL-8 induziert. NOD2-Varianten, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung, dem M. Crohn, assoziiert sind, zeigen eine defekte Sensorfunktion für Bakterienwandbestandteile und eine verminderte IL-8 Induktion und Sekretion.

Derzeitige Arbeiten beschäftigen sich u.a. mit weiteren homologen Proteinen (NOD3, NOD9 und 27) die sich – wie NOD2 – in genetischen Kopplungsregionen chronisch-entzündlicher Erkrankungen befinden. Ihre konservierte Struktur mit einer N-terminalen "caspase-recruitment" Domäne lässt eine NOD2–ähnliche Funktion vermuten. Die funktionelle Charakterisierung dieser Proteine für die epitheliale Barrierefunktion umfasst die Identifikation nachgeschalteter Signalwege und Darstellung NOD3, NOD9 und NOD27- abhängiger mRNA Expressionsprofile. Protein-Interaktionspartner werden über Yeast Two Hybrid und TAF-TAP Ansätze untersucht. Für alle bearbeiteten orthologen Gene der Maus sind Knock-out Modelle in unterschiedlichen Stadien der Bearbeitung.

Dieser Schwerpunkt wird derzeit um weitere "interdiszplinäre" transgene Modelle erweitert. In einer interdisziplinären Zusammenarbeit zur Evolution angeborener Immunität mit Prof. Bosch (Institut für Zoologie) werden NOD und NALP Proteine in basalen aquatischen Metazoen (Cnidariern) untersucht. Mittels systematischem data mining von EST Bibliotheken und der Herstellung eigener Bibliotheken wird die Genstruktur und Sequenz der orthologen Gene bestimmt. Die ORFs werden kloniert und in Expressionsvektoren zur Herstellung von transgenen Cnidariern verbracht. Weitere Arbeiten sollen folgende Techniken umfassen: Herstellung von chimären Proteinen zur Charakterisierung der Liganden und nachgeschalteten Signalwege, Generierung stabiler hair pin siRNA Vektoren zum Ausschalten von NODs in vivo.

Weiterer Schwerpunkt der Arbeiten ist die Charakterisierung von NOD2-abhängigen Signaltransduktionswegen: z.B. Untersuchung phylogenetisch konservierte Protein-Protein Interaktionspartnern, die von funktionell homologen Resistenzgenen der Pflanzen abgeleitet worden sind (heat shock Proteine und Protein Phosphatasen), Beteiligung von Proteinen, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen, Zusammenhang von Autophagosom und NOD Signalwegen und molekulare Aufklärung der Signalwege mittels genomweiter siRNA Transfektion. Im Rahmen des ZMB wird von der Gruppe eine zentrale Hochdurchsatzplattform für zellbasierte Assays aufgebaut. Hierzu steht ein vollautomatisches Zellkultursystem der Fa. Tecan (Freedom Evo 200) zur Verfügung. Die Plattform, die parallel bis zu 40.000 Einzelexperimente in 96/384 well Zellkulturplatten bewältigen kann, ist darauf ausgelegt, genomweite siRNA Bibliotheken bzw. große pharmazeutische Substanzbibliotheken in Screeningexperimenten zu bearbeiten.

Resistenzen gegen phytopathogene Nematoden

Einen Schwerpunkt der Arbeiten stellen Resistenzen gegen pflanzenparasitäre Nematoden dar, die an den Wurzeln vieler Nutzpflanzen erhebliche Schädigungen verursachen. Diese Nematoden sind mit Pestiziden nur schwer zu bekämpfen. Daher stellen resistente Pflanzen eine sinnvolle Alternative für die Pflanzenproduktion dar. Die Resistenz beruht auf Genen, die Wachstum und Entwicklung des Parasiten in der Pflanze behindern. Das weltweit erste Gen Hs1^pro-1, welches Resistenz gegen Wurzelzystennematoden bewirkt, wurde vor einigen Jahren am Lehrstuhl Pflanzenzüchtung kloniert. Dabei handelt es sich um ein recht kurzes Gen von 840 Basenpaaren Länge, welches nicht durch Introns unterbrochen ist. Für das Gen ist bisher keine Funktion im Stoffwechsel der Zelle bekannt. Das Gen wurde aus einer Translokation kloniert, die am Ende des Chromosoms 9 der Zuckerrübe angeheftet ist. Dabei handelt es sich um ein Stück DNA der Wildart Beta procumbens, die als einzige Verwandte der Zuckerrübe Resistenz gegen Wurzelzystennematoden zeigt. Die Translokation ist in den 80er Jahren von Arbeitsgruppen in Holland und Deutschland entdeckt worden und wird heute in der Rübenzüchtung genutzt. Sie beherbergt jedoch nicht nur das Hs1^pro-1-Gen, sondern auch noch zahlreiche weitere Gene, die dazu führen, dass resistente Zuckerrüben eine vergleichsweise schlechte Leistung zeigen und nur unter Befallsbedingungen anbauwürdig sind. Daher ist es auch von züchterischem Interesse, das Gen mittels Gentransfer gezielt in anfällige Eliteformen zu überführen, um es so für die Sortenzüchtung nutzbar zu machen.

Nach der Klonierung des transkribierten Teils des Gens wurde aus einer genomischen Bibliothek die Promotorregion mit ca. 1500 Basenpaaren identifiziert. Der Promotor wurde eingehend untersucht und es wurden bestimmte regulative DNA-Elemente entdeckt, die die Transkription des dahinter liegenden Gens steuern. Interessanterweise wurde stromabwärts vom Transkriptionsstart eine kurze Sequenz gefunden, die für die Aktivität des Promotors im Nährzellengewebe verantwortlich ist. Es wurde festgestellt, dass das Hs1^pro-1-Gen fast ausschließlich nach Infektion des Nematoden in den Nährzellen aktiv ist. Es handelt sich also um einen Pathogen-responsiven Promotor, der beispielsweise genutzt werden kann, um Letalgene gezielt in Nährzellen anzuschalten und so den Parasiten die Nahrungsgrundlage zu entziehen.

Weiterhin wurden die Lokalisation des Hs1^pro-1-Proteins innerhalb der Zelle untersucht. Dazu wurde das Hs1^pro-1-Gen mit dem Gen für das green fluorescent protein (GFP) fusioniert und in Pflanzen eingeführt. Diese Pflanzen produzieren nun ein Fusionsprotein aus GFP und Hs1^pro-1. So konnte im Mikroskop die Fluoreszenz innerhalb der Zelle beobachtet werden. Die Studien ergaben, dass das Protein in der Zellmembran lokalisiert ist. Dies stimmt mit Sequenzvoraussagen überein, die auf eine Transmembrandomäne schließen lassen.

Schließlich wurde das Hs1^pro-1-Gen in Expressionsvektoren kloniert und in E. coli transformiert, so dass die Bakterien nun dieses Protein produzieren. Das gereinigte Protein wurde mittels Mikroinjektion in Nährzellen eingebracht, um so die Reaktion der Zelle studieren zu können. Es konnte gezeigt werden, dass die Injektion des Proteins zum Absterben der Nährzellen und damit zum Tod des Nematoden führen.

Das Hs1^pro-1-Gen wurde in hairy-root-Kulturen der Zuckerrübe funktionell untersucht. Derartige Wurzelklone können durch Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens erzeugt werden. Es stellt sich heraus, dass nach Expression des Gens entweder unter einem konstitutiven Promotor oder unter dem eigenem Hs1^pro-1-Promotor die Entwicklung der Nematoden an den Wurzeln stark behindert war.

Da transgene Zuckerrüben nur sehr schwer herzustellen sind, wurde am Lehrstuhl Pflanzenzüchtung Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) als Modell für das weitere Studium der Wirt-Parasitinteraktionen gewählt. Das Hs1^pro-1-Gen wurde in anfällige A. thaliana-Pflanzen transformiert und es wurden transgene Linien erzeugt, die das Gen stabil exprimieren. Unter einer Vielzahl von Linien wurde eine Linie selektiert, die eine deutlich verringerte Nematodenentwicklung zeigte. Damit konnte zum ersten Mal demonstriert werden, dass das Hs1^pro-1-Gen auch in einer nicht verwandten Art Resistenz auslösen kann. Diese Arbeiten werden derzeit in Kooperation mit dem Department of Phytopathology der Iowa State University in den USA fortgesetzt.

Inzwischen haben eigene Studien ergeben, dass in der Nähe des Hs1^pro-1-Gens ein zweites Gen liegen muss, welches ebenfalls Resistenz gegen sedentäre Zystennematoden bewirkt. Dieses Gen wird derzeit über seine Position auf der gleichen Translokation kloniert. Dazu wurde eine physische Karte der Translokation erstellt, die aus überlappenden BAC-Klonen mit zusammen ca. 800.000 Basenpaaren Länge besteht. Im Augenblick wird dieser Bereich sequenziert, um anhand der Sequenz das zweite Nematodenresistenzgen identifizieren zu können. Es handelt sich dabei um eine typische Vorgehensweise zur Klonierung von Genen aus komplexen Genomen, deren Lokalisation auf einem der Chromosomen zuvor mit Methoden der Rekombinationskartierung bestimmt wurde.

Blüh- und Schossgene
Projektleiter: Prof. Dr. Christian Jung

Früh schossende Wildrübe mit

dem Schossgen B.

Weiterhin erforscht die Gruppe die genetischen Ursachen für den Übergang von der vegetativen in die generative Phase im Lebenszyklus einer Pflanze. Viele Pflanzen in unseren Breiten blühen erst nach einer längeren Phase kühler Temperaturen. Als Modell dient die Zuckerrübe, die erst im zweiten Jahr anfängt, die Sprossachse zu strecken („Schossen“), um danach zu blühen. Wir haben ein Gen identifiziert, welches das frühe Schossen wenige Wochen nach der Aussaat verursacht. Das Gen wurde auf Chromosom 2 der Zuckerrübe mit molekularen Markern kartiert. Ausgehend von diesen Markern wurde eine physische Karte mit Hilfe von BAC-Klonen erstellt. Zurzeit wird derjenige BAC-Klon identifiziert, der mit größter Wahrscheinlichkeit das Schossgen beherbergt. Der Klon wird sequenziert und aus der Sequenz werden Kandidaten für das Schossgen identifiziert.

Dieses Gen ist von großem Interesse für die Pflanzenzüchtung, weil es die Steuerung des Blühverhaltens der Zuckerrübe ermöglicht. Dies ist die Grundlage für die Züchtung von Winterrüben, die bereits im Herbst ausgesät werden können. Der Anbau von Winterrüben ist derzeit in unseren Breiten nicht möglich, weil die Zuckerrüben nach dem Winter Schossen würden und infolge dessen keine Speicherrüben ausbilden würden. Zwar gibt es komplett schossresistente Rüben, diese sind jedoch für die Züchtung nicht nutzbar, weil mit ihnen kein Saatgut erzeugt werden kann. Erst mit Hilfe des klonierten Schossgens kann die Schossneigung in derartigen Rüben gezielt gesteuert werden, so dass zum Zwecke der Saatgutproduktion schossende und blühende Rüben erzeugt werden können. Im Gegensatz dazu ist das Schossgen während der Produktion von Zuckerrüben abgeschaltet und die Rüben verharren im vegetativen Zustand. Die Produktion von Winterrüben könnte die Anbauwürdigkeit der Zuckerrübe unter europäischen Klimabedingungen verbessern, weil sie deutlich höhere Erträge erwarten lässt. Außerdem könnte der Erntezeitpunkt vorverlegt werden, was von erheblicher ökonomischer Bedeutung für die Zucker-produzierende Industrie ist.

Abbildung: Molekulare Markerkarte der Zuckerrübe mit drei züchterisch wichtigen Majorgenen

Gene für männliche Blütenbildung

Projektleiter: Prof. Dr. Christian Jung

Auch das dritte Gen, an dessen Klonierung am Lehrstuhl Pflanzenzüchtung gearbeitet wird, hat große Bedeutung für die Pflanzenzüchtung. Das Gen steuert die Bildung männlicher Blütenorgane beim Spargel. Spargel ist eine zweigeschlechtliche Pflanze; männliche und weibliche Blüten kommen auf unterschiedlichen Pflanzen vor. Die gezielte Steuerung der männlichen Blütenbildung ist in der Pflanzenzüchtung von großem Interesse, weil sie die Bestäubungslenkung, d.h. die gezielte Übertragung des Pollens von einer Spender- auf eine Empfängerpflanze ermöglicht. Dies ist eine Grundbedingung für die Hybridzüchtung, die bei vielen Nutzpflanzen zu erheblichen Ertragssteigerungen geführt hat. Das Ziel besteht darin, das Geschlechtsgen des Spargels beziehungsweise Gene mit ähnlicher Funktion aus anderen Pflanzen gezielt an- bzw. abzuschalten, um so männlich fertile bzw. männlich sterile Pflanzen zu erzeugen.

Das Gen für männliche Blütenbildung (Sexgen) wurde mit Hilfe molekularer Marker auf dem Chromosom 5 des Spargels lokalisiert. Die Marker ermöglichen dem Züchter die Erkennung reinerbiger männlicher Pflanzen, die sich phänotypisch von heterozygoten männlichen Pflanzen unterscheiden. Dies ist für die Züchtung wichtig, weil reinerbige Pflanzen zur Erzeugung von Hybridsaatgut verwendet werden müssen. Im anderen Fall spalten die Sorten in männliche und weibliche Pflanzen auf, was zu geringeren Erträgen führt, weil weibliche Pflanzen bedingt durch Blüte und Samenbildung ein geringeres Sprosswachstum zeigen. Analog zum Schossgen der Zuckerrübe werden physische Karten vom Chromosom 5 des Spargels erstellt. Dazu wurde eine genomische Bibliothek in BAC-Vektoren erzeugt, aus der mit Hilfe der sehr eng gekoppelten molekularen Marker BAC-Klone identifiziert wurden. Nach der Einengung der physischen Karte auf ein bis drei BACs werden diese sequenziert, um aus der Sequenz auf das Gen schließen zu können.

Projektleiter: Prof. Dr. Christian Jung

Raps speichert in den Samen Tocopherole, hauptsächlich g-und a-Tocopherol. Das Ziel der Rapszüchtung besteht darin, den Gesamtgehalt zu erhöhen sowie das Verhältnis von a- zu g –Tocopherol zu modifizieren. Ausgehend von den in A. thaliana klonierten Genen der Tocopherol-Synthese werden die entsprechenden Gene im Raps identifiziert. Ihre Lage im Genom wird mit molekularen Markern bestimmt. Außerdem wird ihr Anteil an der quantitativen Variation bezüglich Tocopherolgehalt ermittelt. Die Marker sollen zur Selektion von Hoch-Tocopherol Formen eingesetzt werden.

Erweiterung der genetischen Variation zur Erhöhung der Heterosis bei Raps

Projektleiter: Prof. Dr. Christian Jung

Hybridsorten sind beim Raps seit Jahren auf dem Vormarsch. Das Problem der Hybridzüchtung bei dieser Art besteht im Fehlen heterotischer Genpools und der relativ engen genetischen Diversität innerhalb dieser Art. Um die Hybridzüchtung auf eine breitere Basis zu stellen, wurden chinesische semi winter Formen mit deutschen Eltern gekreuzt. Es konnte gezeigt werden, dass die chinesischen Formen bedingt durch Einkreuzungen aus den Grundarten sich deutlich von den europäischen Rapsherkünften unterscheiden. Dies erklärt die zum Teil hohe Heterosis der Hybriden.

Selektion von Rapsmutanten mit niedrigem Sinapingehalt

Projektleiter: Prof. Dr. Christian Jung

Das Rapsschrot enthält ca. 40% Protein mit einem hohen Anteil essentieller Aminosäuren. Derzeit lassen sich die Proteine aus dem Pressrückstand der Samen aufgrund antinutriver Substanzen (phenolische Bitterstoffe; z.B. Sinapin) kommerziell nur schlecht nutzen. Ziele des Projektes sind die Verbesserung der Samen- und Proteinqualität von Raps sowie die Herstellung eines repräsentativen EMS-Mutantensortiments und die Identifizierung von niedrig-Sinapin-Mutanten mittels TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). Dafür wurde eine umfangreiche Mutantenpopulation erstellt, die mit der TILLING Strategie gesichtet wird.

Die oben genannten Forschungsarbeiten dienen dazu, die Wirkungsweise züchterisch wichtiger Gene zu verstehen und die Ausprägung bestimmter Eigenschaften gezielt zu steuern. Am Ende sollen der Züchtung Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zur Verfügung gestellt werden. Dazu werden gentechnische Verfahren genutzt, um Gene gezielt in Nutzpflanzen einzubringen und zu steuern.

Signaltransduktion: Strukturelle und kinetische Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen Protein-Tyrosin-Phosphatasen und Protein-Kinasen

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Extrazelluläre Signale wie Wachstums- oder Stressfaktoren werden über membrangebundene Rezeptoren an Guaninnukleotid-Austauschfaktoren weitergeleitet, welche den ‚Ras-Schalter‘ durch den GDP -> GTP-Austausch einschalten. Das Ras Protein aktiviert daraufhin eine Signalkaskade aufgebaut aus drei in Serie geschalteten Serin/ Threonin- bzw. dualspezifischen Proteinkinasen. Am Ende dieser Kaskade steht die Kinase ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinase). Diese wird von der vorgeschalteten Kinase durch Phosphorylierung aktiviert und unter anderem durch Wechselwirkung mit der Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTPase) PTP-SL deaktiviert. In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Stefan Szedlacsek (Universität Bucharest, Rumänien) konnten wir die Kristallstruktur der katalytischen Komponente der PTP-SL als ersten Vertreter einer KIM-PTPase (KIM, Kinase-Interaktions-Motiv) aufklären. Aktuell befassen wir uns mit der Strukturaufklärung der binären Komplexe zwischen ERK1/2 und PTP-SL. Proteinkinasen sind etablierte Zielmoleküle für medizinische Anwendungen und werden bereits sehr intensiv charakterisiert. Proteinphosphatasen als Gegenspieler der Proteinkinasen werden noch nicht analog breit untersucht, so dass über ihr Potential in der medizinischen Forschung noch vergleichsweise wenig bekannt ist. Mittelfristiges Ziel unserer Arbeiten ist daher, die Phosphatase PTP-SL bzw. verwandte Enzyme als mögliche Zielmoleküle für niedermolekulare Zellregulatoren zu charakterisieren. Dieses Projekt wurde bzw. wird von der DFG, Alexander von Humboldt-Stiftung und einem NATO Förderprogramm gefördert.

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DNA-Methylierung: Struktur-Funktions-Analyse bakterieller DNA-Methyltransferasen

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Viele Organismen von Bakterien bis hin zu Säugetieren erweitern ihren Informationsgehalt der genomischen DNA durch sequenzspezifische Methylierung. Diese DNA Methylierung hat vielfältige biologische Funktionen: z.B. Schutz vor endogenen Restriktionsendonukleasen, Steuerung der Reparatur von Fehlern in der Basenpaarung nach DNA Replikation und der Regulation von Genexpression. Die Methylierung von DNA erfolgt durch die Übertragung einer aktivierten Methylgruppe von dem Kofaktor S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) auf eine extrazyklische Aminogruppe von Adenin oder Cytosin (N-DNA MTasen) oder auf die C5 Position von Cytosin (C-DNA MTasen).
In Kooperation mit Professor Elmar Weinhold (RWTH Aachen) haben wir die Struktur der N6-Adenin-DNA MTase aus Thermus aquaticus (M.TaqI) in Komplex mit Substrat-DNA und eines synthetischen, nicht-reaktiven Kofaktoranalogons (AETA) aufgeklärt (Goedecke et al., 2001). Mit Hilfe dieser Struktur konnten wir erstmals direkt zeigen, dass das Zieladenin aus dem DNA-Doppelstrang herausklappt (‚base flipping‘) und die resultierende verzerrte Konformation der DNA durch spezifische Wechselwirkungen mit dem Protein transient stabilisiert wird. Ziel dieses Projektes ist die Strukturaufklärung von weiteren Methyltransferasen bzw. (noch zu identifizierender) Demethylierungsenzymen (RNA- und Aminosäuren-MTasen). DNA-Methyltransferasen können potentielle therapeutische Ziele für die Entwicklung von Medikamenten darstellen: das gezielte Ausschalten von MTasen in Bakterien kann z.B. einen neuen Ansatz für Antibiotika liefern. Daher stellt die Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehungen verschiedener DNA-Methyltransferasen eine wesentliche Ergänzung der aus den verschiedenen Genomprojekten resultierenden Folgeuntersuchungen dar.

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RedOx-Enzymsysteme: Sox Enzym System

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Der Mechanismus der bakteriellen Oxidation von reduzierten anorganischen Schwefelverbindungen zu Sulfat ist bis heute unbekannt, wenngleich zahlreiche Einzelreaktionen beschrieben wurden: Rhodanese, Thiosulfat-Dehydrogenase, Flavocytochrom c-Sulfid-Dehydrogenase, Sulfid-Chinon-Reduktase, Polythionat-Hydrolase bzw. ein Thiosulfat-oxidierendes Multienzymsystem. Die Kenntnis der Einzelreaktionen führte zu komplexen, biochemische Lücken überbrückenden Modellen der Stoffwechselwege der Oxidation von Schwefelverbindungen. Vergleichende Analysen der Genome phototropher und lithotropher schwefeloxidierender Bakterien ergaben zahlreiche Gene, deren abgeleitete Genprodukte homolog zu denen der Sox-Proteine von P. pantotrophus waren. Das sox-Gencluster von P. pantotrophus enthält 15 Gene, ORF1, ORF2, shxVW und soxXYZABCDEFGH.
Ziel dieses Projektes ist, den molekularen Mechanismus der biologischen Schwefeloxidation des chemotrophen Bakteriums Paracoccus pantotrophus mit kristallographischen, biochemischen, spektroskopischen und elektrochemischen Methoden in einer kooperativen Forschung mit Prof. C. Friedrich (Universität Dortmund) zu beschreiben. Zielsetzung für die Proteinstrukturanalyse ist die Aufklärung aller für die Schwefeloxidation essentieller Proteine bzw. Proteinkomplexe aus P. pantotrophus (das minimale Systeme besteht aus zwei Einzelproteinen (SoxB und SoxF) sowie den drei Heterodimeren SoxXA, SoxCD und SoxYZ). Die Struktur von SoxXA konnte inzwischen aufgeklärt werden. Weitere Komplexe des Multienzymsystems sind in unterschiedlichen Stadien der Strukturaufklärung (Expression, Kristallisation, Verfeinerung, Publikation).

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RedOx-Enzymsysteme: NAD(P)H-abhängige Dehydrogenasen

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Ziel ist die Strukturaufklärung bestimmter Dehydrogenasen, welche Zuckermoleküle umsetzen, die für klinische, diagnostische bzw. biotechnologische Nutzung interessant sind. In Zusammenarbeit mit Prof. F. Giffhorn (Universität des Saarlandes) haben wir eine Anhydro-1,5-D-fructose-Reduktase (AFR) kristallographisch aufgeklärt. 1,5-AF ist ein Kohlenhydratderivat, das vermutlich unter Prokaryonten und Eukaryonten weit verbreitet ist. Jedoch ist die Funktion und der Metabolismus in den einzelnen Organismen bis heute noch weitgehend unverstanden. Aufgrund seiner chemischen Eigenschaften sind 1,5-AF und seine Derivate auch für die chemische Industrie als Ausgangsverbindung in der Kohlenhydratchemie von Interesse. Von der Struktur erhoffte man sich neue Einblicke in die Substrat- und Kosubstrat-bindung, sowie neue Erkenntnisse über den Mechanismus der katalysierten Reaktion. Aus diesen Erkenntnissen wäre es zum Beispiel möglich, gezielt Modifikationen am Enzym vorzunehmen, um neue Substrat- oder Kosubstratspezifikationen zu erzielen, die wiederum eine effizientere Biokatalyse gewährleisten würden. Ausgehend von Homologieanalysen und der hochaufgelösten Struktur konnten wir beispielsweise dieses Enzym gentechnisch so verändern, dass es anstelle des biotechnologisch ‚teuren’ NADPH als Kofaktor auch NADH als Kofaktor umsetzen kann.

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Protein-Protein-Docking: Entwicklung eines Protein-Protein-Docking-Algorithmus und Anwendungen des Algorithmus bei der Struktur-Funktionsanalyse von Protein-Komplexen

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Hans-Peter Lenhof (Universität Saarbrücken) und Prof. Dr. Peter Bayer (Universität Essen) arbeiten wir an der Entwicklung neuer Protein-Docking-Algorithmen. Ziel ist, die Strukturaufklärung bzw. Vorhersage von Proteinkomplexen zu beschleunigen, indem NMR-Shiftdaten und/oder Röntgendiffraktionsdaten als Bewertungsfilter für die Dockingsimulation integriert werden. Innerhalb dieser Kooperation befassen wir uns ebenfalls mit dem strukturbasierenden Entwurf von Inhibitoren, welche insbesondere ausgedehnten Protein-Protein-Kontaktflächen blockieren. Bislang konzentriert sich das Wirkstoffdesign auf die Blockade ‘taschenförmiger’ aktiver Zentren, die durch kleine Moleküle gut ausgefüllt werden können. Vielfältige biochemische Regulationsmechanismen beruhen jedoch auf spezifischer Wechselwirkung zwischen großen Biomakromolekülen, so dass die Blockade dieser Wechselwirkungen neue therapeutische Ansätze liefern kann. Dieses Projekt wurde im Rahmen eines DFG Schwerpunktprogramms intensiv gefördert.

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Virale Proteine: Strukturelle Charakterisierung viraler Hüllproteine

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Im Rahmen des Teilprojektes 7 der Klinischen Forschergruppe KFO 129 ‚ Mechanismen der Resistenzentwicklung und Optimierung antiviraler Strategien bei Hepatitis C Virusinfektion unter Einbeziehung integrativer Modelle der Biomathematik und Bioinformatik’ arbeiten wir an der strukturellen Charakterisierung der Hüllproteine E1 und E2 des Hepatits-C Virus. Hierzu werden die Disulfidbrücken-Muster beider Proteine mittels chemischer und biophysikalischer Methoden analysiert, um erste Informationen über die dreidimensionale Architektur dieser Proteine ableiten zu können. Parallel zu diesen Untersuchungen werden verschiedene Domänen der Proteine sowie ein Bindungsepitop der Wirtszelle exprimiert und aufgereinigt, um die kristallographische Röntgenstrukturanalyse einleiten zu können. Diese Untersuchungen werden ergänzt durch die Strukturaufklärung von E1- bzw. E2-spezifischen Antikörperfragmenten.

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Vesikulärer Transport: Strukturelle Charakterisierung von Rab4-abhängigen Regulatoren des vesikulären Transports

Projektleiter: Prof. Dr. Axel J. Scheidig

Dieses langjährige Projekt befasst sich mit Proteinen des vesikulären Transportes. Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens konnten wir bereits die Strukturen verschiedener Vertreter aufklären (Ypt51p, Ypt7p, Gyp1-46p und Rab4a). Aktuell befassen wir uns in enger Kooperation mit Prof. Dr. Peter van der Sluijs (University Medical Center Utrecht; Niederlande) mit der GTPase Rab4 und dessen Effektoren. Rab GTPasen sind essentielle Regulatoren des vesikulären Transportes, indem sie u.a. sehr spezifisch mit Effektorproteinen in der GTP-Form wechselwirken. Rab4 ist an verschiedenen endosomalen Transportprozessen beteiligt. Bislang beschriebene Effektoren für Rab4 sind: Rabaptin-5, Rabenosyn-5, RCP, Syntaxin 4, Rab4ip, CD2AP/CMS und Dynein LIC. Im vorliegenden Vorhaben soll die 3D-Architektur von verschiedenen Rab4-Effektoren alleine bzw. in Komplex mit Rab4 aufgeklärt werden. Als Methoden sollen überwiegend die Röntgenkristallographie aber auch Fluoreszenzspektroskopie, FT-IR-Spektroskopie und BIAcore-Messungen eingesetzt werden. Diese Fragestellung wird im Rahmen eines Teilprojektes des DFG-SFB 530 bearbeitet.

Stoffwechselweg der Nahrungsfette von der Aufnahme bis zu den Insulinsensitiven Zellen

Projektleiter: Prof. Dr. Frank Döring

In einem Stoffwechselweg-orientierten Ansatz (pathway-orientated nutrigenomic approach) untersuchen wir die Funktion und Regulation ausgewählter Gene für den Transport, die Bindung und die Aktivierung von Fettsäuren. Außerdem identifizieren und analysieren wir in den Genen der Fettassimilation funktionell wirksame Polymorphismen und Haplotypen, die mit Zeichen des Metabolischen Syndroms wie z. B. Adipositas assoziiert sind (nutrigenetic approach). Hierdurch werden Risikogene aufgedeckt, deren Verständnis grundlegend ist für zukünftige Strategien der Genom-orientierten Ernährungsprävention und Ernährungsintervention. Somit wird der primär erkenntnisstiftende Ansatz durch einen Krankheits-orientierten Ansatz ergänzt. Dabei stehen die Gene für Acyl-CoA-Bindungsprotein (ACBP), Fettsäurebindungsprotein 2 (FABP2) und Medium-Acyl-CoA-Synthetase 2 (MACS2) im Fokus (Link). Diese Arbeiten werden vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen des Kieler Netzwerkes Nahrungsfette und Stoffwechsel finanziert.

Coenzym Q10 und Genexpression

Projektleiter: Prof. Dr. Frank Döring

Abbildung: Struktur und Funktionen von Coenzym Q10

Coenzym Q10 (CoQ10) wird im menschlichen Körper in nahezu allen Zelltypen synthetisiert. Es wird aber auch über die Nahrung und in Form von Nahrungs-ergänzungsmitteln dem Organismus zugeführt. CoQ10 ist ein notwendiger Bestandteil der oxidativen Phosphorylierung, wirkt als potentes Antioxidant in Mitochondrien sowie in Lipidmembranen und ist Cofaktor der Entkopplungsproteine. Diese Funktionen von CoQ10 werden in klinischen Studien genutzt, um die Symptome neurodegenerativer Erkrankungen, (z. B. Morbus Parkinson), mitochondriale Myopathien und altersabhängige Erkrankungen zu reduzieren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass CoQ10 mehrere hundert Gene reguliert, die für Signaltransduktion, Stoffwechsel und Nährstofftransport bedeutsam sind. Die molekularen Mechanismen dieser neu entdeckten Funktion von CoQ10 sind nicht bekannt. Deshalb ist es unser Ziel, die genaue Rolle von CoQ10 in der Genexpression aufzuklären. Hierfür setzen wir Monocyten in-vitro und ex-vivo sowie Humanexperimente ein. Dieses Projekt wird von der Kaneka Corporation finanziert.

Regulatorische Komplexität in einem einfachen Metazoen: Verständnis der molekularen Logik im Verhalten von Stammzellen in Hydra
Projektleiter: Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. G. Bosch

Kooperationspartner:
Prof. Kiyokazu Agata und Prof. Noriko Funayama (Kyoto University) / The Evolution and Biodiversity Global Center of Excellence (COE) (Japan)

Die Aufklärung der Mechanismen, mit Hilfe derer eine Zelle entscheidet zu proliferieren oder zu differenzieren, ist wichtiges Thema der Stammzellbiologie und gleich bedeutsam für ein Verständnis von humanen Stammzellen wie für jede andere Stammzelle. Durch eine Kombination von genetischen, zell- und molekularbiologischen Ansätzen sowie dem Einsatz von „computational biology“ arbeiten wir an der Identifikation von Genen, die in Hydra direkt an der Kontrolle des Stammzellverhaltens beteiligt sind.

Das Projekt wird über die DFG Sachbeihilfe gefördert.

Als Technologien dienen eine Kombination von genetischen, zell- und molekularbiologischen Ansätzen sowie der Einsatz von „computational biology“.

Derzeitiger Stand des Projektes / aktuelle Publikationen:

• Khalturin K, F Anton-Erxleben, S Milde, C Plötz, J Wittlieb, G Hemmrich, and TCG Bosch (2007) Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Developmental Biology, in press.
• Bosch TCG (2007) Why polyps regenerate and we don´t: towards a cellular and molecular framework for Hydra regeneration. Developmental Biology 303 (2):421-433.
• Hemmrich G, B Anokhin, H Zacharias, TCG Bosch (2007) Molecular phylogenetics in Hydra, a classical model in evolutionary developmental biology. Molecular Phylogenetics and Evolution 44, 281–290.
• Wittlieb J, K Khalturin, J Lohmann, F Anton-Erxleben, and TCG Bosch (2006) Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 103: 6208-6211.
• Comments in PNAS 103:6415 “Trembleys polyps go transgenic”, FAZ, ZEIT, WELT u.a. Listed in “Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics”, 3rd edition. Editor: George P. Rédei John Wiley & Sons, Hoboken, NJ. Fig 1 was incorporated in text book “Molecular Cell Biology”, 6th edition, (Harvey Lodish, editor).
• Augustin R, A Franke, K Khalturin, R Kiko, S Siebert, G Hemmrich & TCG Bosch (2006) Dickkopf related genes are components of the positional value gradient in Hydra. Developmental Biology 296: 62–70.
• Bosch, T.C.G. (2007) Symmetry breaking in stem cells of the basal metazoan Hydra. Prog Mol Subcell Biol. 45:61-78.
• Bosch TCG (2004) Control of asymmetric cell divisions: will cnidarians provide an answer? BioEssays 26(9) 929-931.

Molekulare Mechanismen der epithelialen Abwehr im stammesgeschichtlich alten Vielzeller Hydra
Projektleiter: Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. G. Bosch

Kooperationspartner:
Prof. Dr. rer. nat. Jens-Michael Schröder
Prof. Dr. rer. nat. J. Grötzinger
Prof. Dr. David Miller, Comparative Genomics Centre, Townsville, Australia

Das Epithel von Hydra hat eine starke antimikrobielle Aktivität. Ziel des Projektes ist die umfassende Aufklärung der Signaltransduktionskette, die zu epithelialen Abwehrmechanismen in Hydra und anderen Cnidaria führt.

Das Projekt ist Bestandteil des Sonderforschungsbereiches 617 (DFG) der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel (Molekulare Mechanismen der epithelialen Abwehr), Teilprojekt A1

Als Technologie wird eine Kombination aus Gewebeextraktion / säulenchromatographischer Aufreinigung von antibakteriellen Peptiden und umfangreiche Transkriptom/ Genom Analyse verwendet. Von diversen Cnidaria sind mittlerweile umfangreiche EST Datenbanken wie auch komplette Genomanalysen verfügbar.

Derzeitiger Stand des Projektes / aktuelle Publikationen:

• Hemmrich G, D Miller, and TCG Bosch (2007) The evolution of immunity - A low life perspective. Trends in Immunology, in press.
• Miller DJ, G Hemmrich, E E Ball, D C Hayward, K Khalturin, N Funayama, K Agata, and TCG Bosch (2007) The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss . Genome Biology 8(4): R59.

Interactions between Complex Barriers and Microbiota in the Ocean
Projektleiter: Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. G. Bosch

Kooperationspartner:
Profs. S. Schreiber, J. La Roche, P. Rosenstiel, R. Schmitz-Streit (Kiel)

Microbial consortia on marine multicellular host organisms are attractive model systems to understand the complex interplay of challenge that is also relevant to the human barrier organs and its microbiota. To elucidate the dialogue between an organism and its biotic environment and to better understand the host responses to pathogen invasion in basal metazoans, we started to dentified the bacteria associated with the tissue from three Hydra species as well as marine Cnidaria. We also identify and investigate the evolution and function of orthologs to human susceptibility genes for barrier dysfunction in marine organisms. The primary objective is to trace the diversification of disease-related genes in marine organisms subject to high selective pressure. This will lead to a better understanding of the interaction between barrier and environment and aid in an understanding of the evolutionary pressures which have shaped human diversity profiles.

Das Projekt ist Bestandteil des Exzellenzclusters "The Future Ocean" / SFB 617

Derzeitiger Stand des Projektes / aktuelle Publikationen:

• Fraune S, and TCG Bosch (2007) Long-term maintenance of species-specific bacterial microbiota in the basal metazoan Hydra. Proc Natl Acad Sci USA, in press.

Towards a molecular code of individuality: analysis of ancestral natural killer cells, natural killer cell signaling, and individually variable genes in the urochordate Botryllus schlosseri and Ciona intestinalis
Projektleiter: Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. G. Bosch

Kooperationspartner: Dr. Konstantin Khalturin

How ancestral chordates discriminate between self and nonself is not known. To analyse the mechanisms of allorecognition in ancestral chordates, we screen for proteins with high degree if interindividual variability in Ciona and examine their function in distinguishing self from nonself. The project will shed light on the evolution of the innate immune system in deuterostomes as well as on the emergence of adaptive immunity.

Das Projekt wird über die DFG Sachbeihilfe gefördert.

Zum technologischen Einsatz kommt eine Kombination von genetischen, zell- und molekularbiologischen Ansätzen sowie Einsatz von „computational biology“.

Derzeitiger Stand des Projektes / aktuelle Publikationen:

• Khalturin K and TCG Bosch (2007) Self / nonself discrimination at the basis of chordate evolution: limits on molecular conservation. Curr Opinion in Immunology, 19 (1): 4-9.
  
• Kurn U, Sommer F, Bosch TC, Khalturin K. (2007) In the urochordate Ciona intestinalis zona pellucida domain proteins vary among individuals. Dev Comp Immunol. 2007 Apr 26; [Epub ahead of print]
• Kurn U, Sommer F, Hemmrich G, Bosch TC, Khalturin K. (2007) Allorecognition in urochordates: identification of a highly variable complement receptor-like protein expressed in follicle cells of Ciona. Dev Comp Immunol 2007;31(4):360-71. Epub 2006 Aug 8.
• Khalturin K, Kurn U, Pinnow N, Bosch TC (2005) . Towards a molecular code for individuality in the absence of MHC: screening for individually variable genes in the urochordate Ciona intestinalis. Dev Comp Immunol 2005;29(9):759-73. Epub 2005 Mar 4.
• Khalturin K, Z Pancer, MD Cooper, and TC G Bosch (2004) Recognition strategies in the innate immune system of ancestral chordates. Molecular Immunology 41, 1077-1087.